دانلود روشهای بیوتکنولوژی اصلاح گیاهان دارویی 28 ص (docx) 27 صفحه
دسته بندی : تحقیق
نوع فایل : Word (.docx) ( قابل ویرایش و آماده پرینت )
تعداد صفحات: 27 صفحه
قسمتی از متن Word (.docx) :
1200150-28575
روشهای بیوتکنولوژی اصلاح گیاهان دارویی
مقدمهاگرچه کاشت گياهان دارويي به هزاران سال پيش باز مي‌گردد ولي بايد گفت که در مورد اصلاح آنها تاکنون پيشرفت قابل ملاحظه‌اي صورت نگرفته است و در حال حاضر، تعداد کالتيوارهاي مفيد بهدست آمده بر اثر اصلاح گياهان دارويي اندک است. هدف از اصلاح گياهان دارويي، افزايش کميت و کيفيت آن دسته از مواد مؤثره در اين گياهان است که در صنايع دارويي از اهميت خاصي برخوردار هستند. در سال‌هاي اخير توجه خاصي از جانب سازمان‌هاي مختلف در کشورهاي جهان در ارتباط با اصلاح اين گياهان صورت گرفته است. در این راستا استفاده از تکنیکهای وابسته به کشت بافت و بیوتکنولوژی به منظور ارتقاء صفات کمی و کیفی و کاهش زمان اصلاح نباتات از اهمیت خاصی برخوردار است.
کشت بافت
با تکنیک کشت بافت می توان از یک سلول به یک گیاه کامل دست یافت. در این تکنیک از روشهای جنین زایی ریزازدیادی و اندام زایی استفاده میگردد.استفاده از این تکنیک به همراه موتاسیون باعث سرعت بخشیدن به تکثیر انبوه تولید گیاهان عاری از بیماری انجام کار در تمام طول سال و کاهش هزینه خواهد شد.
اولین مرحله تکثیر قسمت مورد نظر در گیاه می باشد.پس از تعیین دز مناسب و انجام تیمار پرتوتابی و تکثیر دوباره گزینش درشرایط In-vitro با اعمال تیمار تنش صورت میگیرد .گیاهان گزینش شده بعد از انتقال به گلدان جهت سازگاری و تکثیر دوباره جهت سلکسیون انتهایی در مزرعه کشت شده و سپس مورد بررسی های تغییرات زنتیکی قرار خواهند گرفت.
يکي از بخش‌هاي مهم بيوتکنولوژي “کشت بافت” است که کاربردهاي مختلف آن در زمينه گياهان دارويي، از جنبه‌هاي مختلفي قابل بررسي است:
باززايي در شرايط آزمايشگاهي ( In-Vitro Regeneration )
تکثير گياهان در شرايط آزمايشگاهي، روشي بسيار مفيد جهت توليد داروهاي گياهي باکيفيت است. روش‌هاي مختلفي براي تکثير در آزمايشگاه وجود دارد که از جملة آنها، ريزازديادي است. ريزازديادي فوايد زيادي نسبت به روش‌هاي سنتي تکثير دارد. با ريزازديادي مي‌توان نرخ تکثير را بالا برد و مواد گياهي عاري از پاتوژن توليد کرد. گزارش‌هاي زيادي در ارتباط با بکارگيري تکنيک ” کشت بافت ” جهت تکثير گياهان دارويي وجود دارد. با اين روش براي ايجاد کلون‌هاي گياهي از تيرة لاله در مدت 120 روز بيش از 400 گياه کوچک همگن و يک شکل گرفته شد که 90 درصد آنها به رشد معمولي خود ادامه دادند. براي اصلاح گل انگشتانه، از نظر صفات ساختاري، مقدار بيوماس، ميزان مواد مؤثره و غيره با مشکلات زيادي مواجه خواهيم شد ولي با تکثير رويشي اين گياه از راه کشت بافت و سلول، مي‌توان بر آن مشکلات غلبه نمود. چنان‌که مؤسسة گياهان دارويي بوداکالاز در مجارستان از راه کشت بافت و سلول گل انگشتانه موسوم به آکسفورد، توانست پايه‌هايي کاملاٌ همگن و يک شکل از گياه مذکور بهدست آورد.
باززايي از طريق جنينزايي سوماتيک (غيرجنسي)
توليد و توسعة مؤثر جنين‌هاي سوماتيک، پيش‌نيازي براي توليد گياهان در سطح تجاري است. جنينزايي سوماتيک فرآيندي است که طي آن گروهي از سلول‌ها يا بافت‌هاي سوماتيک، جنين‌هاي سوماتيک تشکيل مي‌دهند. اين جنين‌ها شبيه جنين‌هاي زيگوتي (جنين‌هاي حاصل از لقاح جنسي) هستند و در محيط کشت مناسب مي‌توانند به نهال تبديل شوند. باززايي گياهان با استفاده از جنينزايي سوماتيک از يک سلول، در بسياري از گونه‌هاي گياهان دارويي به اثبات رسيده است. بنابراين در اين حالت با توجه به پتانسيل متفاوت سلول‌هاي مختلف در توليد يک ترکيب دارويي، مي‌توان گياهاني با ويژگي برتر نسبت به گياه اوليه توليد نمود.
حفاظت گونه‌هاي گياهان دارويي از طريق نگهداري در سرما
با تکيه بر کشت بافت و سلول مي‌توان براي نگهداري کالتيوارهاي مورد نظر در بانک ژن يا براي نگهداري طولاني مدت اندام‌هاي تکثير گياه در محيط نيتروژن مايع، اقدام نمود. نگهداري در سرما، يک تکنيک مفيد جهت حفاظت از کشت‌هاي سلولي در شرايط آزمايشگاهي است. در اين روش با استفاده از نيتروژن مايع (196- درجه سانتي‌گراد) فرآيند تقسيم سلولي و ساير فرآيندهاي متابوليکي و بيوشيميايي متوقف شده و در نتيجه مي‌توان بافت يا سلول گياهي را مدت زمان بيشتري نگهداري و حفظ نمود. با توجه به اينکه مي‌توان از کشت‌هاي نگهداري شده در سرما، گياه کامل باززايي کرد، لذا اين تکنيک ميتواند روشي مفيد جهت حفاظت از گياهان دارويي در معرض انقراض باشد. مثلاً بر اساس گزارشات منتشر شده، روش نگهداري در سرما، روشي مؤثر جهت نگهداري کشت‌هاي سلولي گياهان دارويي توليدکنندة آلکالوئيد همچون Rauvollfia serpentine , D. lanalta , A. belladonna , Hyoscyamus spp . است. اين تکنيک، ميتواند جهت نگهداري طيفي از بافت‌هاي گياهي چون مريستم‌ها، بساک و دانة گرده، جنين، کالوس و پروتوپلاست به‌کار رود. تنها محدوديت اين روش، مشکل دسترسي به نيتروژن مايع است.
توليد متابوليت‌هاي ثانويه از گياهان دارويي
از لحاظ تاريخي، اگرچه تکنيک ” کشت بافت ” براي اولين بار، در سال‌هاي 1940-1939 در مورد گياهان به‌کار گرفته‌شد، ولي در سال 1956 بود که يک شرکت دارويي در کشور آمريکا ( Pfizer Inc ) اولين پتنت را در مورد توليد متابوليت‌ها با استفاده از کشت توده‌اي سلول‌ها منتشر کرد. کول و استابو (1967) و هبل و همکاران (توانستند مقادير بيشتري از ترکيبات ويسناجين ( Visnagin ) و ديوسجنين ( Diosgenin ) را با استفاده از کشت بافت نسبت به حالت طبيعي (استخراج از گياه کامل) بهدست آورند. گياهان، منبع بسياري از مواد شيميايي هستند که به‌عنوان ترکيب دارويي مصرف مي‌شوند. فرآورده‌هاي حاصل از متابوليسم ثانويه گياهي ( Secondary Metabolite ) جزو گرانبهاترين ترکيب شيميايي گياهي ( Phytochemical ) هستند. با استفاد از کشت بافت مي‌توان متابوليت‌هاي ثانويه را در شرايط آزمايشگاهي توليد نمود. لازم به‌ذکر است که متابوليت‌هاي ثانويه، دسته‌اي از مواد شامل اسيدهاي پيچيده، لاکتون‌ها، فلاونوئيدها و آنتوسيانين‌ها هستند که به‌صورت عصاره يا پودرهاي گياهي در درمان بسياري از بيماري‌هاي شايع به‌کار برده مي‌شوند.
راهکارهاي افزايش متابوليت‌هاي ثانويه گياهي از طريق کشت بافت
1- استفاده از محرک‌هاي ( Elicitors ) زنده و غير زنده‌اي که مي‌توانند مسيرهاي متابوليکي سنتز متابوليت‌هاي ثانويه را تحت تأثير قرار داده و ميزان توليد آنها را افزايش دهند. لازم به‌ذکر است که اين محرک‌ها در شرايط طبيعي نيز بر گياه تأثير گذاشته و باعث توليد يک متابوليت خاص مي‌شوند.
2- افزودن ترکيب اولية ( Precursor ) مناسب به محيط‌کشت، با اين ديدگاه که توليد محصول نهايي در نتيجه وجود اين ترکيبات در محيط‌کشت، القاء شود.3- افزايش توليد يک متابوليت ثانويه در اثر ايجاد ژنوتيپ‌هاي جديدي که از طريق امتزاج پروتوپلاست يا مهندسي ژنتيک، بهدست مي‌آيند.
4- استفاده از مواد موتاژن جهت ايجاد واريته‌هاي پربازده
5- کشت بافت ريشة گياهان دارويي (ريشه، نسبت به بافت‌هاي گياهي ديگر، پتانسيل بيشتري جهت توليد متابوليت‌هاي ثانويه دارد)
مثال‌هاي قابل ذکر آنقدر زياد است که تصور ميشود هر ماده‌اي با منشاء گياهي، از جمله، متابوليت‌هاي ثانويه را مي‌توان به‌وسيلة کشت‌هاي سلولي توليد کرد: از جمله ترکيباتي که از طريق کشت سلولي و کشت بافت به توليد انبوه رسيده است، داروي ضد سرطان تاکسول است. اين دارو که در درمان سرطان‌هاي سينه و تخمدان به‌کار مي‌رود از پوست تنه درخت سرخدار ( Taxus brevilifolia L. ) استخراج مي‌گردد. از آنجايي‌که توليد تاکسول به‌دليل وجود 10 هستة استروئيدي در ساختار شيميايي آن بسيار مشکل است و جمعيت طبيعي درختان سرخدار نيز براي استخراج اين ماده بسيار اندک است، لذا راهکار ديگري را براي توليد تاکسول بايد به‌کار گرفت. در حال حاضر، براي توليد تاکسول از تکنيک کشت بافت و کشت قارچ‌هايي که بر روي درخت رشد کرده و تاکسول توليد مي‌کنند، استفاده مي‌گردد.سولاسودين ( Solasodine ) نيز از ترکيبات ديگري است که از طريق کشت سوسپانسيون سلولي گياه Solanum eleganifoliu بهدست مي‌آيد. از جمله متابوليت‌هاي ديگري که از طريق تکنيک کشت بافت و در مقياس تجاري توليد ميشود، شيکونين ( Shikonin ) (رنگي با خاصيت ضد حساسيت و ضد باکتري) است. مثال‌هاي زير گوياي کارايي تکنيک کشت بافت در توليد متابوليت‌هاي ثانويه است.توليد آلکالوئيد پيروليزيدين ( Pyrolizidine ) از کشت بافت ريشة Senecio sp ، سفالين ( Cephaelin ) و امتين ( Emetine ) از کشت کالوس Cephaelis ipecacuanha ، آلکالوئيد کوئينولين ( Quinoline ) از کشت سوسپانسيون سلولي Cinchona ledgerione و افزايش بيوسنتز آلکالوئيدهاي ايندولي با استفاده از کشت سوسپانسيون سلولي گياه Catharanthus roseus .
استفاده از بيورآکتورها در توليد صنعتي متابوليت‌هاي ثانويه
توليد متابوليت ثانوية گياهي با خصوصيات دارويي در شرايط آزمايشگاهي، فوايد زيادي در مقايسه با استخراج اين ترکيبات از گياهان، تحت شرايط طبيعي دارد. کنترل دقيق پارامترهاي مختلف، سبب ميشود که کيفيت مواد حاصل در طول زمان تغيير نکند. درحالي که در شرايط طبيعي مرتباٌ تحت تأثير شرايط آب و هوايي و آفات است. تحقيقات زيادي در زمينة استفاده از کشت‌هاي سوسپانسيون و سلول گياهي براي توليد متابوليت‌هاي ثانويه صورت گرفته است. از جمله ابزارهايي که براي کشت وسيع سلول‌هاي گياهي به‌کار رفته‌اند، بيورآکتورها هستند. بيورآکتورها، مهمترين ابزار در توليد تجاري متابوليت‌هاي ثانويه از طريق روش‌هاي بيوتکنولوژيک، محسوب مي‌شوند.
مزاياي استفاده از بيورآکتورها در کشت انبوه سلول‌هاي گياهي عبارتند از:1- کنترل بهتر و دقيق‌تر شرايط خاص مورد نياز براي توليد صنعتي ترکيبات فعال زيستي از طريق کشت سوسپانسيون سلولي
2- امکان تثبيت شرايط در طول مراحل مختلف کشت سلولي در بيورآکتور3- جابجايي و حمل‌ونقل آسان‌تر کشت (مثلاً، برداشتن مايه‌کوبه در اين حالت راحت است)4- با توجه به اينکه در شرايط کشت سوسپانسيون، جذب مواد غذايي به‌وسيلة سلول‌ها افزايش مي‌يابد، لذا نرخ تکثير سلول‌ها زياد شده و به‌تبع آن ميزان محصول (ترکيب فعال زيستي) بيشتر ميشود.
5- در اين حال، گياهچه‌ها به آساني توليد و ازدياد مي‌شوند.
سيستم بيورآکتور براي کشت‌هاي جنين‌زا و ارگانزاي چندين گونة گياهي به‌کار رفته است که از آن‌جمله مي‌توان به توليد مقادير زيادي سانگئينارين ( sanguinarine ) از کشت سوسپانسيون سلولي Papaver somniferum با استفاده از بيورآکتور، اشاره کرد. با توجه به اينکه بيورآکتورها، شرايط بهينه را براي توليد متابوليت‌هاي ثانويه از سلول‌هاي گياهي فراهم مي‌آورند، لذا تغييرات زيادي در جهت بهينه‌سازي اين سيستم‌ها، براي توليد مواد با ارزش دارويي (با منشأ گياهي) همچون جينسنوسايد ( ginsenoside ) و شيکونين صورت گرفته است.
نشانگرهاي مولکولي
بخش مهم بعدي داراي کاربرد فراوان در حوزة گياهان دارويي، “نشانگرهاي مولکولي” است. قبل از اينکه به موارد کاربرد نشانگرهاي مولکولي پرداخته شود، لازم است دلايل لزوم استفاده از نشانگرهاي مولکولي در زمينة گياهان دارويي ذکر شود:
دلايل استفاده از نشانگرهاي مولکولي در زمينة گياهان دارويي
فاکتورهايي همچون خاک و شرايط آب و هوايي، بقاي يک گونة خاص و همچنين محتواي ترکيب دارويي اين گياه را تحت تأثير قرار مي‌دهند. در چنين حالاتي علاوه بر اينکه بين ژنوتيپ‌هاي مختلف يک گونه تفاوت ديده ميشود از لحاظ ترکيب دارويي فعال نيز با هم فرق مي‌کنند. در هنگام استفادة تجاري، از اين گياه دو فاکتور، کيفيت نهايي داروي استحصالي از اين گياه را تحت تأثير قرار مي‌دهند:
1- تغيير محتواي يک ترکيب دارويي خاص در گياه مورد نظر
2- اشتباه گرفتن يک ترکيب دارويي خاص با اثر کمتر که از گياهان ديگر بهدست آمده است. به‌جاي ترکيب دارويي اصلي که از گياه اصلي بهدست مي‌آيد.چنين تفاوت‌هايي، مشکلات زيادي را در تعيين و تشخيص گياهان دارويي خاص، با استفاده از روش‌هاي سنتي (مرفولوژيکي و ميکروسکوپي)، به‌دنبال خواهد داشت. براي روشن‌شدن موضوع به مثال زير توجه کنيد:
کوئينون يک ترکيب دارويي است که از پوست درخت سينکونا ( cinchona ) بهدست مي‌آيد. پوست درختان سينکونا که در جلگه‌ها کشت شده‌اند، حاوي کوئيوني است که از لحاظ دارويي فعال است. گونه‌هاي مشابهي از اين درخت وجود دارند که به‌روي تپه‌ها و زمين‌هاي شيبدار رشد مي‌کنند و از لحاظ مرفولوژيکي (شکل ظاهري) مشابه گونه‌هايي هستند که در جلگه‌ها رشد مي‌کنند، اما در اين گونه‌ها کوئيون فعال وجود ندارد.در طول دهه‌هاي گذشته، ابزارهايي که براي استانداردسازي داروهاي گياهي به‌وجود آمده‌اند، شامل ارزيابي ماکروسکوپيک و ميکروسکوپيک و همچنين تعيين نيمرخ شيميايي ( Chemoprofiling ) مواد گياهي بوده‌اند. قابل ذکر است که نيمرخ شيميايي، الگوي شيميايي ويژه‌اي براي يک گياه است که از تجزية عصارة آن گياه به‌وسيلة تکنيک‌هايي چون TLC و HPTLC و HPLC بهدست آمده است. ارزيابي ماکروسکوپيک مواد گياهي نيز بر اساس پارامترهايي چون شکل، اندازه، رنگ، بافت، خصوصيات سطح گياه، مزه و غيره صورت مي‌گيرد. علاوه بر اين، بسياري از تکنيک‌هاي آناليز، همچون آناليز حجمي ( Volumetric Analysis )، کروماتوگرافي گازي (Gas Chromatography )، کروماتوگرافي ستوني ( Column Chromatography ) و روش‌هاي اسپکتروفتومتريک نيز براي کنترل کيفي و استانداردسازي مواد دارويي گياهي، مورد استفاده قرار مي‌گيرند.گرچه در روش‌هاي فوق، اطلاعات زيادي در مورد يک گياه دارويي و ترکيبات دارويي موجود در آن فراهم آيد، ولي مشکلات زيادي نيز به‌همراه دارد. مثلاً براي اينکه يک ترکيب شيميايي به‌عنوان يک نشانگر ( Marker ) جهت شناسايي يک گياه دارويي خاص، مورد استفاده قرار گيرد، بايد مختص همان‌گونة گياهي خاص باشد، در حالي‌که همة گياهان دارويي، داراي يک ترکيب شيميايي منحصربه‌فرد نيستند. همچنين بين بسياري از مولکول‌هاي شيميايي که به‌عنوان نشانگر و يا ترکيب دارويي خاص مدنظر هستند، هم‌پوشاني معني‌داري وجود دارد؛ اين موضوع در مورد ترکيبات فنولي و استرولي حادتر است.
يکي از عوامل مهم ديگري که استفاده از نيمرخ شيميايي را محدود مي‌سازد، ابهام در داده‌هاي حاصل از انگشت‌نگاري شيميايي (Chemical Fingerprinting) است. اين ابهام، در اثر تجمع مواد مصنوعي در پروفيل شيميايي حادث ميشود. علاوه بر اين، فاکتورهاي ديگري، پروفيل شيميايي يک گياه را تغيير مي‌دهند. که از جمله اين فاکتورها مي‌توان فاکتورهاي دروني چون عوامل ژنتيکي و فاکتورهاي بروني چون کشت، برداشت، خشک‌کردن و شرايط انبارداري گياهان دارويي را ذکر نمود. مطالعات شيموتاکسونوميکي (طبقه‌بندي گياهان بر اساس ترکيبات شيميايي موجود در گياه) که به‌طور معمول در آزمايشگاه‌هاي مختلف استفاده مي‌شوند، تنها مي‌توانند به‌عنوان معيار کيفي در مورد متابوليت‌هاي ثانويه، مورد استفاده قرار مي‌گيرند و براي تعيين کمي اين ترکيبات، استفاده از نشانگرهاي ويژه (شيميايي) که به‌کمک آن به آساني بتوان گونه‌هاي گياهان دارويي را از يکديگر تشخيص داد، يک الزام است. در اين رابطه، همان‌طور که در فوق ذکر شد، در هرگياه يک نشانگر منحصر به فرد را نمي‌توان يافت.
مشکلي که در شناسايي گونه‌هاي گياهان دارويي با استفاده از صفات مرفولوژيک وجود دارد، وجود نام‌هاي گياهشناسي متفاوت در مورد يک گياه در نواحي مختلف جهان است. در اين حالت ممکن است گونه‌هاي گياهان دارويي نادر و مفيد، با گونه‌هاي ديگري که از لحاظ مرفولوژيکي به گياه اصلي شبيه‌اند، اشتباه فرض شوند.بنابراين، با توجه به مشکلات موجود در زمينة شناسايي گياهان دارويي با استفاده از روش‌هاي سنتي و با توجه به پيشرفت محققين در زمينة ايجاد نشانگرهاي DNA ، استفاده از اين تکنيک‌هاي نوين ميتواند ابزاري قدرتمند در استفاده کارا از گونه‌هاي مؤثر دارويي محسوب شود. از جمله مزاياي اين نشانگرها، عدم وابستگي به سن و شرايط فيزيولوژيکي و محيطي گياه دارويي است. پروفيلي که از انگشت نگاري DNA يک گياه دارويي بهدست مي‌آيد، کاملاً به همان گونه اختصاص دارد. همچنين براي استخراج DNA به‌عنوان مادة آزمايشي در آزمايشات نشانگرهاي مولکولي، علاوه بر بافت تازه، مي‌توان از بافت خشک نيز استفاده نمود و از اين رو، شکل فيزيکي نمونه براي ارزيابي آن گونه، اهميت ندارد. نشانگرهاي مختلفي بدين منظور ايجاد شده‌اند که از آن جمله مي‌توان به روش‌هاي مبتني بر هيبريداسيون (مانند RFLP )، روش‌هاي مبتني بر RCR (مانند AFLP ) و روش‌هاي مبتني بر توالي‌يابي (مانند ITS ) اشاره کرد.
برخي موارد کاربرد نشانگرهاي DNA در زمينة گياهان دارويي
ارزيابي تنوع ژنتيکي و تعيين ژنوتيپ (Genotyping)تحقيقات نشان داده است که شرايط جغرافيايي، مواد دارويي فعال گياهان دارويي را از لحاظ کمي و کيفي، تحت تأثير قرار مي‌دهد. بر پاية تحقيقات انجام شده، عوامل محيطي محل رويش گياهان دارويي در سه محور زير بر آنها تاثير مي‌گذارد:1- تاثير بر مقدار کل مادة مؤثرة گياهان دارويي
2- تاثير بر عناصر تشکيل دهندة مواد مؤثره
3- تاثير بر مقدار توليد وزن خشک گياه
عوامل محيطي که تاثير بسيار عمده‌اي بر کميت و کيفيت مواد مؤثرة آنها مي‌گذارد عبارتنداز نور، درجه حرارت، آبياري و ارتفاع محل. بنابراين نياز است که به‌دقت اين موضوع مورد بررسي قرار گيرد. به اين خاطر، بسياري از محققين، تأثير تنوع جغرافيايي بر گياهان دارويي را از لحاظ تغييرات در سطوح مولکول DNA (ژنتيک) مطالعه نموده‌اند. اين برآوردها از تنوع ژنتيکي ميتواند در طراحي برنامه‌هاي اصلاحي گياهان دارويي و همچنين مديريت و حفاظت از ژرم‌پلاسم آنها به‌کار رود.شناسايي دقيق گياهان دارويي
از نشانگرهاي DNA مي‌توان براي شناسايي دقيق گونه‌هاي گياهان دارويي مهم، استفاده کرد. اهميت استفاده از اين نشانگرها، به‌ويژه در مورد گونه‌ها و يا واريته‌هايي که از لحاظ مرفولوژيکي و فيتوشيميايي به هم شبيهند، دوچندان ميشود. گاهي ممکن است بر اثر اصلاح گياهان دارويي کالتيوارهايي به‌وجود آيد که هر چند از نظر ظاهر با ساير افراد آن‌گونه تفاوتي ندارد ولي از نظر کميت و کيفيت مواد مؤثره اختلاف‌هاي زيادي با آنها داشته باشد. در اين حالت اصلاح‌کنندگان چنين گياهاني بايد تمام مشخصات آن کالتيوار را از نظر خصوصيات مواد مؤثره ارايه دهند که شناسايي و معرفي خصوصيات مذکور مستلزم صرف هزينه و زمان زياد از نظر کسب اطلاعات گسترده دربارة فرآيندهاي متابوليسمي گياه مربوطه است. به‌علاوه امکان تغييرپذيري وضعيت توليد و تراوش مواد مؤثره در مراحل مختلف رويش گياه همواره بايد مورد نظر اصلاح‌کننده قرار داشته‌باشد. به‌عنوان مثال، از نشانگرهاي RAPD و PBR براي شناسايي دقيق گونة P.ginseng در بين جمعيت‌هاي جينسنگ ( ginseng ) استفاده شده است. همچنين برخي از محققين از يک راهکار جديد به‌نام DALP ( Direct Amplification of Length Polymorphism ) براي شناسايي دقيق Panax ginseng و Panax quinquefolius استفاده کرده‌اند.
انتخاب کيموتايپ‌هاي (Chemotypes) مناسب به‌کمک نشانگر
علاوه بر شناسايي دقيق گونه‌ها، پيش‌بيني غلظت مادة شيميايي فعال گياهي (Active Phytochemical) نيز براي کنترل کيفي يک گياه دارويي مهم است . شناسايي نشانگرهاي (DNA QTL) که با مقدار آن ترکيب دارويي خاص همبستگي دارند، ميتواند جهت کنترل کيفي و کمي مواد خام گياهي، مؤثر واقع شود. لازم به‌ذکر است که تنها تفاوت بين کيموتايپ‌هاي مختلف، مقدار مادة شيميايي فعال آنها است. همچنين، پروفيل‌هاي حاصل از نشانگرهاي DNA مي‌توانند جهت تعيين روابط فيلوژنتيکي (خويشاوندي) بين کيموتايپ‌هاي مختلف يک گونه گياه دارويي به‌کار روند. در سال‌هاي اخير مطالعات زيادي به‌منظور تعيين رابطة بين نشانگرهاي DNA و تنوعات کمي وکيفي ترکيبات فعال دارويي در بين گونه‌ها و خويشاوندان نزديک گياهان دارويي، صورت گرفته و يا در حال انجام است. از طرفي، به‌کارگيري توأم تکنيک‌هاي مولکولي و تکنيک‌هاي آناليزي ديگر، چون TLC و HPLC ، ميتواند شناخت ما را نسبت به يک گونة دارويي خاص و به تبع آن کنترل کيفي و کمي ترکيب دارويي مورد نظر در سطح صنعتي، افزايش دهد. به‌عنوان مثال بررسي تنوع ژنتيکي Artemisia annua ، به‌عنوان منبع ترکيب ضد ملارياي آرتميزينين (artemisinin)، نشان مي‌دهد که ژنوتيپ‌هاي اين گياه در سراسر هند، از لحاظ محتواي اين ترکيب (مقدار مادة مؤثرة آرتمزينين)، تنوع نشان مي‌دهند. اين بررسي با استفاده از نشانگر RAPD (يک نوع نشانگر DNA ) صورت گرفته است.
مهندسي ژنتيک
شاخة بعدي بيوتکنولوژي که در زمينة گياهان دارويي کاربردهاي فراواني دارد، “مهندسي ژنتيک” است. پيشرفت‌هاي اخير در زمينة ژنتيک گياهي و تکنولوژي DNA نوترکيب، کمک شاياني به بهبود و تقويت تحقيقات در زمينة بيوسنتز متابوليت‌هاي ثانويه کرده است. قسمت اعظمي از تحقيقات در زمينة متابوليت‌هاي ثانويه، به‌روي شناسايي و دستکاري ژنتيکي آنزيم‌هاي دخيل در مسير متابوليکي سنتز يک متابوليت ثانويه، متمرکز شده‌است. ابزار طبيعي که در فرآيند مهندسي ژنتيک و در اکثر گونه‌هاي گياهي و بخصوص گياهان دولپه به‌کار مي‌رود، يک باکتري خاکزي به‌نام آگروباکتريوم (Agrobacterium) است. گونه‌هاي مختلف اين باکتري، مهندسان طبيعي هستند که بيماري‌هاي تومور گال طوقه (Crown Gall Tumour) و ريشة مويي (Hairy Root) را در گياهان سبب مي‌شوند. تحقيقات نشان داده‌است که ريشه‌هاي مويي توليد شده به‌وسيلة گونه‌اي از اين باکتري به‌نام A. rhizogenes ، بافتي مناسب براي توليد متابوليت ثانويه هستند. به علت پايداري و توليد زياد اين بافت‌ها در شرايط کشت عاري از هورمون، تاکنون گونه‌هاي دارويي زيادي با استفاده از اين باکتري تغيير يافته‌اند. که از آن جمله مي‌توان به کشت ريشة مويي گياه دارويي Artemisia annua به‌منظور توليد ترکيب دارويي فعال، اشاره کرد. تحقيقات نشان داده است که شرايط جغرافيايي، مواد دارويي فعال گياهان دارويي را از لحاظ کمي و کيفي، تحت تأثير قرار مي‌دهد.
بنابراين مي‌توان ديد که مهندسي ژنتيک ميتواند به‌عنوان ابزاري قدرتمند جهت توليد متابوليت‌هاي ثانوية جديد و همچنين افزايش مقدار متابوليت‌هاي ثانويه موجود در يک گياه به‌کار رود.
گياهان تراريخته (Transgenic Plants) و اهميت اقتصادي آنها:
فنون دست‌ورزي ژنتيكي گياهان در اوايل دهه 80 ميلادي ابداع گرديد و نتايج كاربردي آن از اوايل دهه 90 با ايجاد گياهان تراريخته مقاوم به آفات، بيماري‌ها و علف‌كش‌ها به ثمر نشست. اكنون حدود دو دهه از پيدايش فنون دي‌ان‌‌آي نوتركيب و مهندسي ژنتيك گياهي مي‌گذرد. در اين مدت سرمايه‌گذاري‌هاي هنگفت و تلاش فراواني در نقاط مختلف دنيا براي توسعه و بهبود اين فنون جهت دستيابي به اهداف موردنظر به‌عمل آمد. مهندسي ژنتيك، انقلاب سبزي را براي بهبود كمي و كيفي محصولات كشاورزي و غلبه بشر بر گرسنگي و فقر غذايي بنيان نهاده است. left0دانشمندان با دست‌كاري ژن‌هاي يك گياه، جانور و ميكروارگانيسم، نژادهاي تراريختهاي از آن را به وجود مي‌آورند كه نسبت به نژاد طبيعي، به آفات و بيماري‌ها و يا سموم مقاوم بوده، يا برخي عناصر غذايي و ويتامين‌ها را كه نوع طبيعي فاقد آن است، توليد مي‌نمايد. لذا اين قبيل گياهان يا جانوران، محصول بيشتر و با كيفيت بهتري توليد مي‌كند. در دهه آينده اميد مي‌رود با استفاده از گياهان زراعي تراريخته، افزايش عملكرد از 10 به 25 درصد برسد. از سال‌هاي 1982 و 1983 كه اولين انتقال موفقيت‌آميز ژن‌ها به سلول‌هاي گياهي انجام شد، سرعت پيشرفت ايجاد گياهان تراريخته افزايش يافت. اولين آزمايش مزرعه‌اي گياهان تراريخته در سال 1986 در كشور فرانسه انجام گرفت. اما استفاده عملي از گياهان تراريخته، زماني آغاز شد كه كشور چين تنباكو و گوجه‌فرنگي تراريخته مقاوم به ويروس را در پايان سال 1992 براي عرضه در بازار تصويب نمود و سپس گوجه‌فرنگي با قابليت انبارداري بيشتر توسط شركت كالگن آمريكا در سال 1994 معرفي شد. امروزه توليد گياهان تراريخته از عمده‌ترين كاربردهاي بيوتكنولوژي در كشاورزي ميباشد. در حال حاضر، انتقال ژن از طريق مهندسي ژنتيك و توليد گياهان تراريخته در مواردي همچون مقاومت به آفات، بيماري‌ها، علف‌كش‌ها، بهبود كيفيت پروتئين و روغن و غيره در بيش از 60 گياه زراعي، باغي و زينتي حاصل شده است و تعداد آنها با سرعت زيادي روز به روز افزايش مي‌يابد. سطح زيركشت اين قبيل گياهان در جهان طي سال‌هاي اخير با روند تصاعدي افزايش يافته و از سال 96 تا 2001 حدود 30 برابر شده است (جدول 1). اكنون بيش از 25 درصد سطح‌كشت جهاني گياهان تراريخته در كشورهاي در حال توسعه قرار دارد. شمار كشورهايي كه گياهان زراعي تراريخته را كشت مي‌كنند، از يك كشور در سال 1992 به چهارده كشور در سال 2002 افزايش يافته است. ميزان فروش محصولات گياهان تراريخته طي سال‌هاي 1995 تا 2000 به‌سرعت افزايش يافت (جدول 2). بازار جهاني گياهان تراريخته در سال 2001 از مرز سه ميليارد دلار گذشت و پيش‌بيني ميشود كه در سال 2005 و 2010 به ترتيب تا حد 6 و 20 ميليارد دلار افزايش يابد. سود حاصل از گياهان تراريخته طي سال 1999 حدود 700 ميليون دلار بود كه بيش از دو ميليون كشاورز از آن بهره‌مند شده‌اند. در سال 2001 حدود پنجونيم ميليون كشاورز از كشت اين قبيل گياهان بهره برده‌اند. لذا اكنون مقبوليت گونه‌هاي جديد زراعي، باغي و حتي دامهاي تراريخته نزد كشاورزان افزايش يافته است و اين خود موضوعي است كه دانشمندان را به سوي توليد فرآورده‌هاي نوين و با قابليتهاي بيشتر سوق مي‌دهد.
پيش‌بيني ميشود كه در سال 2025 حدود 1،6 ميليارد نفر در جهان از طريق مهندسي ژنتيك غلات تغذيه خواهند نمود. شركت زنكا (Zeneca) معتقد است كه بازار جهاني گياهان تراريخته در سال 2020 به 75 ميليارد دلار خواهد رسيد، لذا سرمايه‌گذاري در اين زمينه را از 20 ميليون دلار در سال 97 به 60 ميليون در سال 98 افزايش داد. شركت نوارتيس سوئيس نيز حدود 20 ميليون دلار طي سال‌هاي 99 و 2000 براي گسترش ساختمان موسسه تحقيقات بيوتكنولوژي خود هزينه نمود. كاهش هزينه كشاورزان از طريق كنترل بهينة آفات، بيماري‌ها، علفهاي هرز، كاهش مصرف سموم و افزايش كميت و كيفيت محصول، از جمله مزيت‌هاي حاصل از كاربرد گياهان تراريخته (تغييريافتة ژنتيك) ميباشد. گياهان تراريخته مقاوم به آفات و بيماري‌هاي شايع و خسارت‌زا قادرند خسارات ساليانه 30 درصدي محصولات كشاورزي را كاهش دهند؛ در نتيجه امروزه شاهد رويكرد كشاورزان در كشورهاي صنعتي به سوي كاشت و بهرهبرداري از اين قبيل گياهان هستيم. كاشت اين‌گونه گياهان، هزينه‌هاي مبارزه شيميايي و كاربرد سموم دفع آفات نباتي را كاهش مي‌دهد. از سوي ديگر صدمات وارده به منابع زيستي مثل خاك و آب‌هاي زيرزميني را به حداقل مي‌رساند. براي روشن شدن مطلب به ذكر چند مثال زير بسنده ميشود:
مثالهايي از كاهش خسارات آفات
1- خسارت ناشي از كرم برگ‌خوار ذرت، ساليانه معادل 40 ميليون تن است كه اين ميزان قادر به تامين كالري لازم براي 60 ميليون نفر ميباشد. به‌كمك مهندسي ژنتيك مي‌توان اين‌گونه خسارت‌ها را به حداقل ممكن كاهش داد.
2- تنباكو تراريخته مقاوم به ويروس در چين باعث شد تا عملكرد برگ آن 5 تا 7 برابر افزايش يابد و تعداد دفعات سمپاشي (بر عليه شته‌هاي ناقل) 3-2 بار كاهش يابد. 3- در آمريكا طي سال 1996 متوسط خسارت كرم اروپايي ذرت برابر 9 درصد بود و در بعضي مناطق به بيش از 30 درصد مي‌رسيد و متوسط ارزش خسارت برابر 1 ميليارد دلار بود. سود خالص از ذرت Bt مقاوم به اين آفت (بدون احتساب هزينه‌هاي علف‌كش) برابر با 27.25 دلار در هر ايكر (واحد سطح) محاسبه شد. كل سود خالص حاصل از كاشت ذرت Bt در سال 1996 و 1997 در آمريكا به ترتيب 19 و 190 ميليون دلار بود.
4- سال 1996 در آمريكا كاشت سيب‌زميني Bt (مقاوم به سوسك كلرادو) به طور متوسط تعداد سمپاشي را به 1.2 دفعه كاهش داد كه متوسط پس‌انداز هزينه سمپاشي 5 دلار در هر ايكر (12 دلار در هكتار) بود. در مجموع با صرفه‌جويي در مصرف حشره‌كش، متوسط افزايش بازده كشاورزان با استفاده از سيب‌زميني Bt (در مقايسه با شاهد) برابر 14 دلار در ايكر بود (35 دلار در هر هكتار با احتساب افزايش عملكرد و كيفيت غده).
5- يك بررسي بر روي پنبه تراريخته Bt مقاوم به كرم غوزه طي سال 1996 در آمريكا نشان داد كه عملكرد در مقايسه با شاهد به طور متوسط 7 درصد افزايش مي‌يابد و حتي بسته به تراكم آفت اين افزايش تا 20درصد نيز مي‌رسيد. همچنين ميزان مصرف حشره‌كش 20000 گالن كاهش يافت. ميزان صرفه‌جويي ناشي از عدم به كارگيري حشره‌كش در هكتار معادل 140 تا 180 دلار در هكتار بود و افزايش هزينه خريد بذر در هر هكتار معادل 80 دلار بود. بنابراين متوسط سود خالص در هر هكتار حدود 80 دلار (33 دلار در هر ايكر) محاسبه گرديد. بنابراين سود حاصل از كاشت 1.8 ميليون ايكر پنبه Bt در سال 1996 براي كشاورزان آمريكايي برابر 60 ميليون دلار بود.
6- كل سود حاصل از كشت گياهان پنبه ، ذرت و سيب زميني Bt در آمريكا طي سال 1996 برابر 80 ميليون دلار بود و در سال 1997 ميلادي براي ذرت Bt به تنهايي معادل 190 ميليون دلار بود.
7- سال 1996 در كانادا متوسط عملكرد كلزاي متحمل به علف‌كش مقدار 9درصد بيشتر از تيمارهاي شاهد (روش‌هاي ديگر كنترل علف هرز) بود و حتي به بيش از 20درصد نيز مي‌رسيد. از طرفي ميزان مصرف سم از طريق كاهش تعداد دفعات سمپاشي (80 درصد كشاورزان تنها يك بار سمپاشي نمودند) از 570 گرم به 160 گرم ماده فعال در هر ايكر (1400 گرم در هر هكتار به 400 گرم) كاهش يافت. سود خالص حاصل در يك برآورد متوسط محافظه‌كارانه حدود 20 دلار در هر ايكر (50 دلار در هر هكتار) تخمين زده شد. بنابراين كل سود حاصل در 300 هزار ايكر كلزاي مقاوم به علف‌كش در كانادا برابر 6 ميليون دلار بود.
8- سويا مقاوم به علف‌كش نيز باعث كاهش 40-10 درصد از مصرف علف‌كش ميشود. 9- در استراليا، كشاورزان براي مبارزه با شپشك‌هاي نخود فرنگي هر ساله حدود 16 ميليون دلار حشره‌‌كش‌‌هاي شيميايي خريد مي‌‌نمايند. اين آفت مهمترين عامل كاهش در محصول 100 ميليون دلاري نخودفرنگي استراليا ميباشد. سازمان تحقيقات علمي و صنعتي اين كشور با انتقال يك ژن از لوبيا قرمز توانسته است نخود فرنگي تراريختهاي ايجاد نمايد كه حدود 99.5 درصد در برابر حمله شپشك‌‌ها مقاومت دارد.
219075448945زمينه‌هاي مختلف كاربرد گياهان تراريخته:
1- مبارزه با آفات و بيماري‌ها
يكي از رويكردهاي بيوتكنولوژي براي مبارزه با آفات و بيماري‌هاي گياهي، مقاوم نمودن گياه از طريق دست‌كاري ژنتيك و انتقال ژن ميباشد. توليد گياهان تراريخته حاوي ژن‌هاي توليدكننده پروتئين‌هاي سمي، كه در مقابل آفات خاصي بسيار سمّي و مؤثر بوده و در عين حال براي انسان، گياه، حيات‌وحش و حشرات مفيد، زياني ندارند، از مثال‌هاي كاربردي مهندسي ژنتيك ميباشد.
استخراج ژنBt از باكتري Bacillus Thuringiensis و انتقال آن به ذرّت، پنبه و سيب‌زميني باعث مقاومت آنها در مقابل حشرات شده است. اكنون ميليون‌ها هكتار از اين قبيل گياهان در تعدادي از كشورهاي صنعتي و در حال توسعه جهان كشت ميشود. واضح است كه اين فناوري با از بين بردن نياز به استفاده از سموم شيميايي، چه خدمتي به حفظ محيط‌زيست و صرفه‌جويي اقتصادي كشاورزان -219075483235مي‌نمايد كه در بخش قبلي نيز چند مثال ذكر شد.
در دانشگاه ديويس كاليفرنيا، انتقال ژن mi به گوجه‌فرنگي و ابراز آن در برگ‌‌ها موجب مقاومت به نماتد گره‌‌زاي ريشه (Root knot) و شته ميشود، ولي اين ژن در درجه حرارت‌‌هاي بالاتر در مناطق گرمسيري غيرفعال ميشود و نياز به مطالعات بيشتر دارد.
left0نتقال ژن Bt به باكتري خاكزي سودوموناس فلوئورسنس (Pseudomonas fluorescence) كه با ريشه غلات و سويا همزيست ميباشد و اضافه‌كردن اين باكتري به خاك ميتواند خسارت كرم اگروتيس يا شب‌پره زمستاني (Agrotis ipsilon or Black cutworm) در غلات را كنترل كند. محققان آمريكايي با انتقال ژن Pin2 به گياه برنج باعث مقاوم شدن آن در برابر حشرات شده‌اند.